Дэвид Уильям Духовны родился 7 августа 1960 года в Нью-Йорке, США. В семье было трое детей. Духовны хорошо окончил школу и поступил в Принстонский университет на факультет педагогики, хотел стать писателем. Чтобы заработать на учебу, он подрабатывал доставщиком продуктов, сторожем и барменом. Окончив университет, поступил в аспирантуру в Йельском университете, после окончания которой получил степень магистра английской литературы. На телевидении Дэвид Духовны впервые появился в 1987 году, снявшись в рекламе пива. Он бросает подготовку докторской диссертации и берет уроки сценического мастерства.

В 1988 году артист попадает в Голливуд и снимается в эпизодической роли в фильме Майка Николса «Деловая девушка». Затем режиссер Дэвид Линч пригласил Духовны на роль трансвестита – агента службы по борьбе с наркотиками в трех эпизодах сериала «Твин Пикс». Продюсер студии «XX Век Фокс» Рэнди Стоун обратил на него внимание и порекомендовал Крису Картеру, режиссеру «Секретных материалов», на роль Фокса Малдера. В 1993 году Д. Духовны стал сниматься в научно-фантастическом сериале «Секретные материалы» в ведущей роли агента ФБР Фокса Малдера, которая принесла ему мировую славу.

Начиная с 2007 года актер снимается в популярном комедийно-эротическом телесериале «Блудливая Калифорния», за роль в котором в 2007 году он получил премию «Золотой глобус» в номинации «Лучший актер сериала (комедии/мюзикла)». Параллельно с работой на телевидении Дэвид Духовны продолжает сниматься и в художественных фильмах. Среди его работ в новом тысячелетии – роли в картинах: «Вернись ко мне», «Эволюция», «Тайны прошлого», «Телевизор», «Семейка Джонсов», «Фантом» и других.